细胞复苏流程
1.从液氮罐中取出冻存细胞 ，放入37℃水浴锅中融化 ，轻柔离心后收集细胞沉淀；
2.缓慢用移液枪吸去上清 ，加入适量浓度和体积的完全培养基 ，重悬细胞沉淀 ，转移至细胞培养皿或细胞培养瓶；
3.根据细胞培养皿或者培养瓶的体积 ，补足完全培养基 ，放入二氧化碳培养箱中培养观察。
操作中的注意事项&小妙招
① 小心取出冻存管
许多小型液氮罐的设计是将细胞冻存在带盖的提篮中 ，提篮会浸没在液氮中。由于提篮中没有孔格的划分 ，细胞冻存管无法摆放整齐。取用细胞时候 ，实验人员经常需要逐一查看 ，寻找计划复苏的细胞 ，此过程耗时过久 ，可能会导致其他冻存管内的细胞受损。
一般大型液氮罐会配置成列的冻存架和细胞存储盒 ，取出冻存架和放回都需要平稳小心处理 ，避免带出大量液氮。罐内液氮较多时 ，可适当在罐口附近停留 ，等大部分液氮回流后再拎出。
② 快速融化待复苏细胞
当找到准备复苏的冻存管后 ，不要着急放入水浴锅 ，先检查封口膜是否完整（关于冻存细胞时 ，是否用封口膜的问题 ，有经验的呢 ，都会发现加不加都一样的） ，如果贴了医用胶布 ，胶布是否有破损？因为一旦冻存管中有液氮流入 ，直接放入水浴锅中 ，管内压力骤升 ，可能导致冻存管炸裂 ，危及实验人员。推荐使用内旋的冻存管 ，不宜爆炸。如果只有外旋的冻存管 ，取出后应尽快倒置/水平放置数十秒 ，使得液氮流出。
复苏细胞的核心技术 ，简而言之就是快融。从液氮罐中取出的细胞 ，需及时放入37℃水浴锅 ，进行快速融化 ，期间需不停地轻柔摇晃冻存管。最好在两分钟内完全融化细胞。出于卫生考虑 ，有些细胞房没有水浴锅 ，所以很多复苏操作 ，需要在不同实验室进行。如果两个实验室距离较远 ，且实验室室温较高 ，可提前准备一只干净的烧杯 ，装入37℃的水作中间缓冲。
注意
? 复苏时不要让水浴锅中的水 ，流入冻存管中造成污染。
? 复苏过程中要格外注重无菌操作 ，经水浴锅融化后 ，需对冻存管消毒。最好同时更换手套和口罩 ，全程避免移液器接触管口及管壁。小妙招：将冻存管放入无菌一次性PE手套中 ，再放入水中融化 ，避免污染也方便操作。
③ 轻柔收集细胞
收集细胞前 ，要将所用培养基提前预热并摆放整齐 ，避免现用现配耽误复苏进程 ，及时让刚复苏的细胞接触正常的生长环境。若冻存液中存在DMSO ，请根据所用细胞对其敏感的程度 ，判断要不要离心弃除。离心目的 ，一个是去除DMSO ，一个是去除死细胞。
刚复苏的细胞状态比较脆弱 ，应避免多次吹打和离心。比如原代细胞在复苏融化后 ，尽量不要进行离心操作 ，直接补足培养基 ，使细胞分散均匀 ，等3-6小时 ，细胞贴壁后 ，进行换液处理。此方式也适用于其他冻存状态一般的细胞。
④ 培养前 ，计数&活力检测
复苏过程中 ，细胞计数必不可少。原则上 ，冻存前和复苏后 ，都需要对细胞进行计数和活率分析 ，判断冻存的效果和细胞复苏后的状态。
2018年9月 ，美国药典（USP-NF）出台了关于细胞冻存相关政策并明确指出 ，台盼蓝不能很好地识别刚复苏的细胞（细胞的种类和台盼蓝的浓度不同 ，对染色结果都有较大的影响） ，建议使用两种以上的方法进行细胞计数 ，如结合荧光染色计数法。
⑤ 支原体或细菌的污染。分离培养物 ，检测支原体。清洁支架或培养箱。如发现支原体污染 ，丢弃培养物。建议使用的培养基提前用一次性真空过滤器过滤一下 ，能有效除去支原体、细菌等 ，0.1μm的过滤器可以去除支原体 ，0.22微米去除细菌。
⑥ 复苏的细胞本身状态不好 ，已经老化 ，失去贴附性 ，建议启用新的保种细胞。如果细胞比较珍贵或没有备份细胞 ，可尝试将不贴壁细胞收集离心 ，再用 PBS 将沉淀清洗一遍 ，离心后的沉淀加入胰酶重新消化接种 ，同时提高血清浓度到
15%~20%。
复苏后是否成功 ，根据接种后细胞的形态和贴壁率而定 ，倘若第二天有95%以上的细胞贴壁 ，且形态良好 ，则说明复苏成功。复苏接种的时候 ，采用较高的接种密度 ，使细胞的整体密度高一些 ，有利于细胞的生长。
